Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, например, фенол, подобно тирозину, дает розово-красное окрашивание с реактивом Миллона, поэтому проведения одной какой-либо реакции для установления наличия белка не достаточно.
Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки); 2) специфические – только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот, например реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Миллона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин) и др.
При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:
Цветные реакции на белки (качественные реакции)
| № | Название реакции | Применяемые реактивы | Появление окрашивания | Что открывает данная реакция |
| 1 | Биуретовая и т.д. | |||
| Выводы … |
Цветные реакции на белки Опыт 1. Биуретовая реакция.
Биуретовая реакция – качественная на все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза, которые содержат не менее двух пептидных связей.
Принцип метода. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в белках пептидных связей (- СО – NH -), которые в щелочной среде образуют с сульфатом меди (ІІ) окрашенные в красно-фиолетовый цвет медные солеобразные комплексы. Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например биурет (NH2-CO-NH-CO-NH2), оксамид (NH2CO-CO-NH2), ряд аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин).
Биуретовая реакция с глицином
Порядок выполнения работы.
К 1 мл исследуемого 1% раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) щелочи и затем 2-3 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO4). разбавленного, почти бесцветного раствора медного купороса.
Читайте также:
При положительной реакции появляется фиолетовая окраска с красным либо синим оттенком.
Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу».
Принцип метода. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка, прибавляют 2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь осторожно кипятят (чтобы смесь не выбросило).
При этом выделяется аммиак, который обнаруживается по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипении, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):
Химизм реакции:
-
Читайте также:
| цистеин | серин |
| ацетат свинца | плюмбит натрия |
| черный осадок |
В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца).
При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца:
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH Pb(OH)2 + 2 CH3COONa,
Pb(OH)2 + 2NaOH Na2PbO2 + H2O,
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS + 4NaOH.
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков.
-
Читайте также:
Принцип метода. Эта реакция используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет. Желатин, например, не содержащий ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл 10 %-го раствора белка куриного яйца добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. В результате коагуляции белка в содержимом пробирки образуется белый осадок или помутнение. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется в результате гидролиза. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия (до появления оранжевой окраски раствора).
Химизм реакции:
| тирозин | нитропроизводное тирозина желтого цвета рН 7,0 | хиноидное производное оранжево-желтого цвета рН > 7,0 |
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 4. Реакция Адамкевича (на присутствие в белках триптофана).
Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами глиоксиловой кислоты (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) с образованием окрашенных продуктов конденсации. Реакция протекает по уравнению:
- Читайте также:
Желатин не дает этой реакции, т.к. он не содержит триптофана. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси.
Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H2SO4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают несколько капель неразбавленного белка и прибавляют 2 мл. ледяной уксусной кислоты и несколько капель глиоксиловой кислоты. Смесь слегка нагревают до растворения образующегося осадка, охлаждают и, сильно наклонив пробирку, осторожно по стенке приливают концентрированную H2SO4 так, чтобы обе жидкости не смешивались.
Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 5. Нингидриновая реакция.
Принцип метода. a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция идет по схеме:
Химизм реакции:
| ‑аминокислота | нингидрин | альдегид | восстановленная форма нингидрина (гидриндантин) |
| продукт конденсации сине-фиолетового цвета |
Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.
Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином.
В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 1 мл 1-10%-го разбавленного раствора белка куриного яйца и 1-2 мл 1%-го раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки перемешивают и в течение 2-3 мин осторожно нагревают на водяной бане до появления сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующее о присутствии в белке α-аминокислот.
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 6. Реакция Сакагучи.
Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:
Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:
Порядок выполнения работы.
К 2 мл. 1%-го разбавленного раствора белка куриного яйца добавляют 2 мл. 10%-го гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Затем приливают 0,5 мл. гипобромита натрия (NaBrO) или гипохлорита натрия (натрий хлорноватистокислый – NaOCl), перемешивают. Тотчас появляется красное, постепенно усиливающееся окрашивание.
Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.
Эта реакция характерна для соединений, содержащих остаток гуанидина
NH = C –NH2,
NH2
и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина:
NH = C –NH – (CH2)3 –CH –COOH
NH2 NH2
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Лабораторная работа №1
ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ.
ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Белки представляют собой высокомолекулярные полимерные органические соединения, построенные из остатков различных α-аминокислот, соединенных ковалентной пептидной связью.
Присутствие белка в растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, обусловленных наличием в белке аминокислот, их специфических групп и пептидных связей. Существуют универсальные цветные реакции, т. е. на все белки (биуретовая и нингидриновая), и специфические, т. е. на определенные аминокислоты (ксантопротеиновая, Миллона, Фоля и др.).
На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических лабораториях.
Цель: Ознакомиться с универсальными цветными реакциями на белки и специфическими реакциями на отдельные аминокислоты, содержащиеся в белковых растворах.
Работа 1. Биуретовая реакция на пептидную связь (Пиотровского)
Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью комплексы фиолетового цвета с красным или синим оттенком. Группа, образующая пептидную связь, в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:
При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью. Возникает солеобразная связь. Кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.
Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза – пептоны и полипептиды. Для ди — и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок зависит от длины полипептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в составе не менее двух – CO – NH2-групп, к ним относятся, например, оксамид – NH2 – CO – CO – NH2, биурет – N2H – CO – NH – CO – NH2.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 10% раствор NaOH, 1% раствор CuSO4.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям водного раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 2 капли 1% раствора CuSO4. Содержимое перемешивают. Оно приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток CuSO4, так как синий осадок маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса.
Работа 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты
Белки, полипептиды и свободные α-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя СО2, NH3 и соответствующий альдегид. Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование α-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.
Химизм реакции:
| a‑аминокислота | нингидрин | альдегид | восстановленная форма нингидрина (гидриндантин) |
| продукт конденсации
сине-фиолетового цвета |
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: нингидрин, 1% водный раствор.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям раствора белка приливают 5 капель 0,1% водного раствора нингидрина и кипятят 1–2 мин. Появляется розово-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет. Данная реакция не специфична, так как ее дают некоторые амины и амиды кислот.
Работа 3. Ксантопротеиновая реакция
на циклические аминокислоты (Мульдера)
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, – содержащих в своем составе бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца этих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета. При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет.
Химизм реакции:
| тирозин | нитропроизводное тирозина желтого цвета рН < 7,0 | хиноидное производное оранжево-желтого цвета рН > 7,0 |
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: концентрированная HNO3, 10% раствор NaOH.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавляют 3 капли концентрированной HNO3 и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося белка (под влиянием кислоты), который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10% раствор NaOH (до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина).
Работа 4. Реакция Фоля
на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу (цистеин, цистин)
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. В метионине сера имеет прочное соединение, поэтому эту реакцию не дает. Реакция состоит в том, что при кипячении белка со щелочью цистеин или цистин легко отщепляют серу в виде сернистого натрия, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца. Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот цистина и цистеина и от концентрации белка в растворе.
Реакция протекает по следующим уравнениям:
| цистеин | серин |
| ацетат свинца | плюмбит натрия |
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 30% раствор NaOH, 5% раствор (CH3COO)2Pb.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. В одну пробирку наливают раствор яичного белка, в другую – раствор растительного белка, в третью — раствор желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора 30% NaOH и по 1 капле 5% раствора (CH3COO)2Pb.
При интенсивном кипячении жидкость в пробирке с яичным белком темнеет, образуя черный осадок сернистого свинца. В пробирке с желатином черного осадка не образуется, так как желатин почти не содержит серосодержащих аминокислот.
Оформление работы. Результаты работ оформляют в виде таблицы
| Название
реакции |
Исследуемый
материал |
Употребляемые
реактивы |
Наблюдаемая
окраска |
Чем
обусловлена реакция? |
Вывод: …
Работа 5. Реакция Сакагучи (на аргинин)
Белки, содержащие аргинин, в присутствии щелочи дают красное окрашивание с гипобромитом и a-нафтолом. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, и окисленный аргинин при взаимодействии с a-нафтолом образует продукт конденсации красного цвета.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 10% раствор NaOH, 0,1% спиртовой раствор a-нафтола, 2% гипобромит натрия
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 0,5 мл раствора белка добавляют 0,5 мл 10% раствора щелочи, 3 капли 0,1% спиртового раствора a-нафтола и после перемешивания 2-3 капли 2% раствора гипобромита натрия. Появляется красное окрашивание.
Работа 6. Реакция Милона (на тирозин)
Реакция Милона открывает в белке тирозин, в составе которого имеется фенольный радикал. При нагревании белка с реактивом Милона (смесь нитратов и нитритов ртути (I) и (П), растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в красный цвет. Реактив Милона дает окрашивание почти со всеми фенолами:
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: реактив Милона
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 1 мл раствора белка добавляют 3-5 капель реактива Милона и осторожно нагревают до образования окрашенного в красный цвет осадка.
Работа 7. Реакция Адамкевича (на триптофан)
Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами (глиоксиловой кислотой) с образованием окрашенных продуктов конденсации:
Глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольшом количестве в ледяной уксусной кислоте, которую используют в реакции Адамкевича.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: ледяная (концентрированной) уксусная кислота, Н2SО4 конц.
Оборудование: пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. К 1 мл раствора белка добавляют 1 мл ледяной (концентрированной) уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения осадка. После охлаждения к смеси осторожно добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты (по каплям по стенке пробирки, чтобы жидкости не смешались). Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Работа 8. Реакция Ваузене (на триптофан)
Белки, содержащие триптофан, дают в кислой среде в присутствии нитрита натрия и формальдегида сине-фиолетовое окрашивание. В этой реакции триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием продукта конденсации (бис-2-триптофанилметана), который окисляется нитритом натрия до бис-2-триптофанилкарбинола. Последний в присутствии минеральных кислот образует соли сине-фиолетового цвета.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 2,5% раствор формальдегида, Н2SО4 конц., 0,5% раствор NaNO2
Оборудование: пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. К 2 мл раствора белка добавляют 1 каплю 2,5% раствора формальдегида. К полученной смеси, тщательно перемешивая, добавляют осторожно по каплям 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Через 10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель 0,5% раствора нитрита натрия. Появляется сине-фиолетовая окраска.
Работа 9. Реакция Паули (на гистидин и тирозин)
Реакция Паули позволяет обнаружить в белке аминокислоты гистидин и тирозин, которые образуют с диазобензол-сульфоновой кислотой комплексные соединения вишнево-красного цвета. Диазобензол-сульфоновая кислота образуется в реакции диазотирования при взаимодействии сульфаниловой кислоты с нитритом натрия (или калия) в кислой среде:
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 1% раствора сульфаниловой кислоты, 0,5% раствор NaNO2, 10% раствор Na2CO3.
Оборудование: пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. К 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты (готовится на 5% растворе соляной кислоты) прибавляют 2 мл 0,5% раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл 1% раствора белка и после перемешивания 6 мл 10% раствора карбоната натрия. После перемешивания смесь окрашивается в вишнево-красный цвет.
Оформление работы. Результаты работы оформить в виде таблицы:
| Название реакции | Используемые реактивы | Определяемая аминокислота | Наблюдаемые явления |
Контрольные вопросы
1. Что такое белок?
2. Как связаны между собой аминокислоты в молекуле белка? С помощью какой реакции их можно открыть?
3. Какие аминокислоты, имеющие в своем составе бензольное кольцо. С помощью какой реакции их можно обнаружить?
4. Какие аминокислоты, содержащие серу. С помощью какой реакции их можно открыть?
5. Что открывает нингидриновая реакция?
6. Какая реакция используется для обнаружения аргинина в молекуле белка?
7. Какие аминокислоты позволяет обнаружить в белке реакция Паули?
8. С помощью каких реакций можно обнаружить белки, содержащие триптофан?
9. Какую аминокислоту открывает в белке Реакция Милона?
10. Значение цветных реакций на белки.
